離心機在休止細胞反應(yīng)實驗中的運用

發(fā)布時間：

2021-12-17

概要：

休止細胞反應(yīng)實驗的順利進行需要用到離心機。因為在細胞制備階段細菌收集過程中離心分離提取細胞。

　　休止細胞反應(yīng)實驗的順利進行需要用到離心機。

　　因為在細胞制備階段細菌收集過程中離心分離提取細胞。

　　休止細胞又稱靜息細胞,把培養(yǎng)液中各種營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子洗去后懸浮在生理鹽水中培養(yǎng)一段時間，以消耗內(nèi)源營養(yǎng)物質(zhì)，呈饑餓狀態(tài)的細胞，在研究微生物的生理生化及新陳代謝中有廣泛的應(yīng)用。它的主要特性就是細胞雖然處于休眠狀態(tài)，不進行生長繁殖，但仍含有各種酶系，具有氧化和發(fā)酵能力，在適宜條件下可再恢復生長。另外休止細胞反應(yīng)專一性強，可以提高底物轉(zhuǎn)化率，不易染雜菌，可以減少產(chǎn)物對菌體生長及酶合成的抑制。

　　休止細胞的制備：

　　(1)菌株的活化

　　用接種環(huán)將實驗所需的E. coli CVCC 249接種到已滅菌的固體斜面培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18—24 h。

　　(2)菌株的獲得

　　用接種環(huán)在斜面培養(yǎng)基上刮取適量菌轉(zhuǎn)接至液體三角瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)箱37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD > 1.（大約1.4左右）。

　　(3)細菌的收集

　　將培養(yǎng)好的細胞菌液放入離心管中，離心機4500 rpm 離心收集細胞，棄去上清培養(yǎng)液，用生理鹽水洗滌，洗去培養(yǎng)液，之后離心機4500 rpm離心收集細胞，重復洗滌三次至上清液透明，棄去上清液。

　　(4)菌懸液的制備

　　將離心后的細胞用pH 為7.0 的磷酸緩沖液定量至25 mL，吹懸混勻，為以后實驗使用。

　　(5)休止細胞的制備

　　菌懸液放置在4 ℃條件下放置72 h 后，在37 ℃培養(yǎng)4—8 h，休止細胞制備完成，放在4 ℃冰箱中備用。

　　脫氫酶活性的測定：

　　(1) 在5 mL的離心管中加入1 mL反應(yīng)底物，并根據(jù)底物設(shè)置不同的濃度（同一濃度不同底物對細胞脫氫酶活性影響，如表1所示。不同稀釋度的各種底物對細菌脫氫酶降活性影響，我們做了三種底物的實驗，分別是乙酸鈉，琥珀酸鈉和檸檬酸鈉，如表2，表3和表4所示）。

　　(2) 加入制備的休止細胞0.4 mL，用等體積的5%甲醛處理30 min滅活的細胞懸液作為對照。在加入細胞之前一定注意將休止細胞搖勻后再加。

　　(3) 加入MTT 40 μL ，震蕩搖勻，此時的溶液應(yīng)呈黃色，恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃避光保溫2 h。

　　(4) 加入二甲基亞砜1.3 mL，震蕩混勻后，37 ℃保溫30min ，此時溶液呈深藍紫色。

　　(5) 加入PBS （pH 7.0）1.5 mL，振蕩混勻。

　　(6) 722分光光度計測510 nm的OD ，每個樣品濃度至少要進行三次實驗，變異系數(shù)(coefficient of variation ，CV) 小于5%。

　　酶活性是指酶催化一定化學反應(yīng)的能力。任何一個酶都有催化一定底物進行特定反應(yīng)的能力，但是酶的催化能力的測定實際上只能通過測定酶催化反應(yīng)速度來實現(xiàn)。酶催化反應(yīng)速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。而酶促反應(yīng)速度可用單位時間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。另外，在研究酶促反應(yīng)時，底物一般是過量的，因此一般測定產(chǎn)物的增加量較合適些。由于酶催化反應(yīng)速度受溫度、pH、離子強度及底物等諸多因素的影響，我們所謂的酶活性都是只在特定的系統(tǒng)和條件下測到的反應(yīng)速度，因此在測定酶活性時，一定要注明這些特定的條件。即使同樣的酶，甚至用同樣的測定方法和同樣的單位定義，由于條件稍有不同，也會使測到的酶活性難以比較。因此，要比較各篇文獻報道或者不同牌號制劑的某種酶活性時，必須注意它們的單位定義和測定系統(tǒng)及條件，千萬不能盲目比較。

　　與酶活性相關(guān)的另一個概念是“比活”，食指單位重量的蛋白質(zhì)中所含的某種酶的催化活性，是純度量度，單位為u/mg。比活越高則酶越純。

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